實(shí)驗室設施

開(kāi)展無(wú)菌檢查及微生物限度檢查工作，首先要按照《藥品檢驗所實(shí)驗室質(zhì)量管理規范》及《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規范》的要求，建立一個(gè)布局合理、使用方便、操作安全的無(wú)菌室，并且配有完善的實(shí)驗設施和管理制度。無(wú)菌檢查、微生物限度檢查以及接種室（接種對照菌、菌種傳代）均應嚴格分開(kāi)，具有危險性的毒株、毒素如破傷風(fēng)梭菌、黃曲霉毒素的實(shí)驗室需單獨使用，以便控制防止傳播。

潔凈實(shí)驗室

1.潔凈室的布局

1.1根據樣品檢驗要求，一般應至少包括更衣緩沖系統、微生物限度檢查室、無(wú)菌檢查室、陽(yáng)性菌室和物流通道。

1.2更衣系統應至少包括一更（含更鞋）、二更（含洗手）、緩沖以及人流走廊等。

1.3物流通道應考慮凈污分流的布局，有條件的可設置污物走廊

2.潔凈室的設計要求

2.1凈化級別：潔凈走廊、檢查室、陽(yáng)性菌室應為一萬(wàn)級；其他房間應為十萬(wàn)級

2.2氣流組織：陽(yáng)性菌室對走廊呈負壓，走廊對緩沖有5Pa的正壓；陽(yáng)性菌室全排風(fēng)

2.3電氣控制：控制開(kāi)關(guān)外置；設置通訊系統

3.結構與要求：

無(wú)菌潔凈室不宜設在底層，防潮、防霉、采光好，遠離交通干道，廁所及污染區，面積不超過(guò)10m2，高度不超過(guò)2.4m，由兩個(gè)緩沖間、操作間組成。操作間緩沖間之間應有樣品傳遞窗，出入操作間和緩沖間的門(mén)不應直對。無(wú)菌室內應六面光滑平整，無(wú)縫隙，不起灰，不落塵，耐腐蝕，易清洗，墻壁與地面、墻壁與天花板連接處應呈凹弧形，操作間不得安裝下水道。

   無(wú)菌室內的照明燈應嵌裝在天花板內，采光面積要大，光照應分布均勻，光照度不低于300勒克斯。緩沖間和操作間應裝有紫外線(xiàn)殺菌燈（2－25w/m3）''用于空氣消毒。紫外線(xiàn)波長(cháng)200－300nm者具有殺菌作用，其中以265－266nm殺菌作用最強，這與DNA的吸收光譜范圍一致，其殺菌機理可能是在細菌細胞DNA中引起胸腺嘧啶雙聚體形成，從而干擾細菌細胞DNA復制，導致細菌變異死亡。紫外線(xiàn)殺菌燈1m以?xún)染嚯x殺菌效果最佳，每次開(kāi)燈照射時(shí)間為30min。應定期檢查紫外線(xiàn)燈輻射強度，不得低于70μW·cm-21m距離。其缺點(diǎn)是穿透力弱，一張紙板可以阻礙光的透過(guò)，不能穿透固體物，故只能用作表面消毒及一些不耐熱或化學(xué)消毒劑物品的消毒。

4.溫度、濕度

無(wú)菌室內溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈的殺菌效果，故溫度最好控制在25±2℃，相對濕度40－60％。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應保持對環(huán)境形成正壓，不低于49Pa。

5.操作間

無(wú)菌室內應安裝空氣除菌過(guò)濾層流裝置及調溫裝置。潔凈度要求：凈化工作臺潔凈度為100級，無(wú)菌室應為10000級。

操作間應準備乙醇燈（或煤氣燈），火柴，2％碘酊棉球及75％乙醇棉球、試管架、大小橡皮乳頭、砂輪、記號筆、無(wú)菌剪刀、鑷子、注射器等。微生物限度檢查無(wú)菌室操作間內還應有電子稱(chēng)（感覺(jué)為0.1g，最大稱(chēng)量為300g為宜），電動(dòng)勻漿儀等。

6.緩沖間

緩沖間內應有洗手盆，消毒液，無(wú)菌衣，帽，口罩，拖鞋等，緩沖間內不應放置培養箱和其他雜物。

（二）潔凈室的使用

1.在實(shí)驗開(kāi)始之前1小時(shí)啟動(dòng)風(fēng)機系統（空調系統），并開(kāi)啟空氣消毒裝置，消毒至少半小時(shí)后關(guān)閉

2.觀(guān)察并確保潔凈室的壓差

3.物品經(jīng)物流通道進(jìn)入潔凈室

4.人員正確著(zhù)裝后經(jīng)人流通道進(jìn)入潔凈室

5.使用完畢，應用消毒液清潔工作臺面。實(shí)驗人員在更衣室換下無(wú)菌工作衣后出潔凈工作室。開(kāi)啟空氣消毒裝置，消毒至少半小時(shí)后，關(guān)閉潔凈工作室的控制開(kāi)關(guān)。

（三）潔凈室的清潔維護

1.潔凈室的清潔維護分為日常維護、定期維護和不符合時(shí)的維護。

2.日常維護由每次實(shí)驗的實(shí)驗人員進(jìn)行，維護的范圍為進(jìn)行實(shí)驗的潔凈工作室和輔助潔凈區，維護的頻率為每次實(shí)驗后。

3.定期維護由實(shí)驗室指定專(zhuān)人進(jìn)行，維護的范圍為所有潔凈工作室，維護的頻率為每二周一次。

4.不符合時(shí)的維護由實(shí)驗人員進(jìn)行，維護的范圍為所有不符合的潔凈室，維護的時(shí)機為出現不符合時(shí)

潔凈室的驗證

1.驗證的項目：潔凈度、微生物數、換氣次數、靜壓差、照度、溫度、相對濕度

2.驗證的技術(shù)要求

3.驗證的周期  建議每半年一次，也可根據潔凈室的使用頻率適當增加驗證次數。

4.驗證的方法  潔凈度和微生物數：采用GB/T16292~16294-1996，其他項目：參照JGJ71－90。

5.驗證不符合項的處理

5.1當潔凈度、微生物數、換氣次數、靜壓差等指標出現不符合時(shí)，應停用潔凈室，對凈化系統進(jìn)行調整后，在重新驗證，直至符合規定才能重新啟用潔凈室。

5.2當溫度、相對濕度和照度等指標出現不符合時(shí)，潔凈室可不必停用，但應及時(shí)修復空調系統（或更換照明裝置），使其符合規定。

二、實(shí)驗室管理：

為保證實(shí)驗工作有序進(jìn)行，實(shí)驗室必須制定一系列實(shí)驗室管理制度。

（一） 實(shí)驗室要求：

1實(shí)驗室環(huán)境應清潔、衛生、安靜，實(shí)驗室內嚴禁吸煙和飲食。

2實(shí)驗人員必須穿戴工作衣帽，工作服經(jīng)常洗滌、消毒、保持清潔。

3操作前后或離開(kāi)實(shí)驗室必須用肥皂或消毒液洗手。

4發(fā)生菌液污染臺面或地面，應立即用3％甲醛或5％碳酸等消毒液由外向內傾覆其上，1小時(shí)后再擦拭，如為破傷風(fēng)梭菌，則應隔夜后再擦洗。

5工作衣、帽、口罩受到菌液污染時(shí)，應立即脫下使污染部位包裹在內部，高壓滅菌后再清洗。

6如有傳染性培養物污染手部，應先用75％乙醇棉球擦拭，再浸入0.1%新潔爾滅消毒液內泡手，然后再用肥皂及清水徹底洗干凈。

7接種環(huán)（針），每次使用前后，必須通過(guò)火焰滅菌，冷卻后方可接種培養物，接種帶有蠟質(zhì)、油質(zhì)的培養物或菌苔殘留多時(shí)，不應立即在火焰上灼燒，應先在內焰里將油質(zhì)培養物烘干后再移至火焰上滅菌，以免活菌外濺污染環(huán)境及感染操作者。

8帶菌的吸管應浸泡在5％甲酚消毒液內24h后取出清洗，帶菌的試管或培養物應在121℃高壓滅菌30分鐘后再取出清洗。

9在接種霉菌、放線(xiàn)菌時(shí)應在鋪有浸過(guò)消毒液的紗布上操作，防止孢子散落傳播。

10廢棄物的處理：

必須消除生物危害后，才能處理，一般使用高壓蒸汽滅菌，也可以采用直接焚燒。

污染性銳器（如一次性針頭）應滅菌后處理，注意避免銳器扎傷。

污染性可重復使用的材料（如平皿）應滅菌后清洗，宜使用不易破碎的材料。

工作服（含潔凈工作服）應定期清洗，懷疑污染的工作服應滅菌后清洗，潔凈工作服應滅菌后使用。

（二） 無(wú)菌操作要求：

無(wú)菌操作是指在無(wú)菌的環(huán)境條件下，使用無(wú)菌器材，防止微生物污染的操作技術(shù)。即保持待檢樣品在操作時(shí)不被污染，又要防止被檢的微生物及陽(yáng)性對照菌在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。從事無(wú)菌及微生物操作的工作人員必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)及基礎微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)知識的學(xué)習及培訓才具備上崗操作的資格，微生物專(zhuān)業(yè)檢驗人員也不應該頻繁地變換工作崗位。

1.無(wú)菌室應每次使用前后用0.1%苯扎溴銨溶液或2％甲醛液擦拭工作臺面及可能污染的死角，濕拖地面，打開(kāi)無(wú)菌空氣過(guò)濾器及超凈工作臺的開(kāi)關(guān)30分鐘，紫外線(xiàn)殺菌燈照射1小時(shí)。

2.操作人員用肥皂洗手后進(jìn)入緩沖間換拖鞋，用75％乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。將所需物品剝去牛皮紙及外包裝，從傳遞窗移入操作間，再用0.1%苯扎溴銨溶液泡手后進(jìn)入操作間，在乙醇（或煤氣燈）火焰區（火焰高度3－5cm）操作。

3供試品表面消毒，如為安瓿先用砂輪劃痕后用2％碘酒棉球擦拭，再用75％乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。

4操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人員及口中的雜菌污染供試品。

5在無(wú)菌操作中切勿大幅度或快速動(dòng)作、拖行，以免攪動(dòng)空氣中塵埃微粒。

6注射器如需回抽時(shí)，應對著(zhù)火焰吸入無(wú)菌空氣。

7所用的器材如培養基、稀釋劑配制后經(jīng)濕熱滅菌121℃30分鐘，吸管培養皿等均應洗滌，干燥，包扎后經(jīng)干熱滅菌160℃2小時(shí)才能使用。

三、消毒劑的質(zhì)量控制

（一）消毒劑安全使用原則

1.正確選擇消毒劑的種類(lèi)，盡可能選擇低毒、低殘留的消毒劑。

2.正確選擇使用濃度，確保消毒效果。

3.正確選擇消毒方式，可以浸泡、擦拭或噴霧。

4嚴格掌握消毒時(shí)間。

5.定期更換，避免產(chǎn)生耐藥性。

6.不聯(lián)用和混合使用。

7消毒前，應進(jìn)行清潔。

（二）消毒劑的種類(lèi)

1.高效消毒劑（HLD）：能殺滅一切微生物（包括芽孢），常見(jiàn)的有過(guò)氧乙酸、甲醛、環(huán)氧乙烷和含氯消毒劑

2.中效消毒劑（ILD）：能殺滅抵抗力較強的結核桿菌和其他細菌、真菌和大多數病毒，常見(jiàn)的有乙醇、苯扎溴銨、碘酊和甲酚皂溶液等

3.低效消毒劑（LLD）：能殺滅除結核桿菌以外的抵抗力較弱的細菌以及抵抗力較弱的真菌（如念珠菌）和病毒（如流感病毒、艾滋病毒等），常見(jiàn)的有氯已定、三氯散和高錳酸鉀等

消毒劑配制

1.根據消毒劑使用區域和對象的不同，將消毒劑分成3類(lèi)，分別是：

第一類(lèi)消毒劑，專(zhuān)用于普通實(shí)驗區，僅用于物品外表面的消毒，常用的有聚維酮碘和石炭酸等；

第二類(lèi)消毒劑，專(zhuān)用于潔凈室的更衣室，僅用于佩戴手套的雙手消毒，常用的有苯扎溴銨和75％乙醇；

第三類(lèi)消毒劑，專(zhuān)用于無(wú)菌操作間，直接用于消毒直接接觸藥品的容器表面，也用于實(shí)驗操作過(guò)程中的手部消毒和實(shí)驗臺面消毒，常用的有聚維酮碘溶液和75％乙醇。

2.配制

第一類(lèi)消毒劑的配制方法：不需使用無(wú)菌器具，可直接在普通實(shí)驗區按消毒劑使用說(shuō)明書(shū)的配制方法，用純化水稀釋消毒劑的濃溶液后使用。

第二類(lèi)消毒劑的配制方法：不需使用無(wú)菌器具，應在更衣室內按消毒劑使用說(shuō)明書(shū)的配制方法，用純化水稀釋消毒劑的濃溶液后使用。

第三類(lèi)消毒劑的配制方法：需要使用無(wú)菌器具并在無(wú)菌操作間內配制。首先取一次性集菌過(guò)濾器一個(gè)，將排液口放置在滅菌過(guò)的錐形瓶上，將消毒劑濃溶液通過(guò)薄膜過(guò)濾的方式除菌。然后，按比例取滅菌后的純化水，稀釋濃溶液，制成可供使用的消毒劑。將此消毒劑倒入放置有無(wú)菌脫脂棉球的消毒劑缸中，得到可直接使用的消毒劑棉球。（該類(lèi)消毒劑制備后，應收集消毒劑中的微生物）

四、環(huán)境監控

（一）目的：

確定工作臺面、設備表面的消毒效果和消毒頻次，確定潔凈室的綜合性能以及進(jìn)行維護的時(shí)機，確定培養箱的污染情況，判斷是否有必要進(jìn)行徹底消毒。

（二）環(huán)境監控的對象

1.樣品貯存的環(huán)境

2.培養基制備的環(huán)境

3.樣品制備和檢驗的環(huán)境

4.培養的環(huán)境

（三）環(huán)境監控的方法

1.表面微生物數

擦拭法（棉拭子法）

淋洗法

影印盤(pán)法（RODAC法）

2.空氣微生物數

沉降菌法     浮游菌法

浮游菌數的測定：采用浮游菌測定儀。

沉降菌數測定：方法：無(wú)菌室及凈化工作臺面消毒擦拭后，打開(kāi)層流凈化裝置及凈化工作臺開(kāi)關(guān)30min，將營(yíng)養瓊脂平板3個(gè)及玫瑰紅鈉瓊脂平板3個(gè)（直徑9cm），置凈化工作臺左、中、右各1個(gè)，開(kāi)蓋暴露30min后將蓋蓋上，分別放在30－35℃培養箱內培養48h及25－28℃培養箱內培養72h，細菌和真菌平均菌落數小于等于1個(gè)為100級。實(shí)驗室一旦被污染，潔凈度達不到要求，可以清洗或更換凈化工作臺過(guò)濾器，用甲醛或丙二醇、乳酸熏蒸消毒，方法：在支架上放一個(gè)燒杯（內裝少許甲醛，8ml／平方米），下面放一個(gè)裝有少許乙醇的乙醇燈，點(diǎn)燃后，關(guān)閉門(mén)窗，乙醇用盡后燈自滅，甲醛蒸氣充滿(mǎn)無(wú)菌室，密閉24h。

缺點(diǎn)：甲醛蒸氣易銹蝕儀器，對人有刺激，可用氨水噴霧中和，減少對人眼的刺激。

（四）環(huán)境監控的評價(jià)指標

1.表面微生物數

1.1需氧嗜溫菌小于5cfu/cm2，合格

1.2需氧嗜溫菌在5～25cfu/cm2之間，需進(jìn)一步調查

1.3需氧嗜溫菌大于25cfu/cm2，不合格，應立即消毒處理

2.空氣微生物數

沉降菌大于15cfu/板，應暫停工作，進(jìn)行消毒